Práctica 2: Purifición y caracterización de proteínas

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PROTEÍNA

1) INFORMACIÓN SOBRE PROTEÍNA DE INTERÉS:

• Constitutiva o inducida, tejido o célula
• Intracelular o extracelular
• Unida a la membrana,
• Si es albumina o globulina o glutelina o prolamina,
• Solubilidad: sales, solventes orgánicos, polielectrolitos, sales de iones (Zn, Cu, Fe), policationes, ácidos
• Secuencia de amino ácidos: carga neta a diferentes pHs, pI, peso molecular,
• Modificada después de la traducción: fosforilada, glicosilada, hidrolisada
• Detección: enzima (detección substrato o producto), anticuerpo, proteína marcada (proteína verde fluorescente),absorbancia

no información, entonces, información de proteínas similares

2) PURIFICACIÓN

En cada paso de purificación:

Cuantificar proteínas (prueba de Biuret, xantoproteinica, lowry, Bradford, ninhidrina), observar pureza por electroforesis, actividad enzimática,% purificación y % recuperación

• Extracción: rompimiento de tejido o célula
• Precipitación
• Diferentes cromatografías: exclusión molecular, intercambio ionico, afinidad

3) CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNA PURA

Composición química: C,O,H,S; anillos fenolico, enlaces disulfuro,

• Secuenciación de amino ácidos,
• Cinética enzimática
• Cristalografia de rayos X,prediccion estructura secundaria, terciaria, cuaternaria

Detección de amino ácidos y proteínas:

Composición general: de C, N, H y S calentando proteína (C) en un tubo seco con papel tornasol (amoniaco) y acetato de plomo (S).

Determinación nitrógeno: Lassaigne

Determinación azufre

colorimétricamente por Absorbancia o por cromatografía en capa delgada

1. Absorbancia: cualitativa y cuantitativa

• Absorción UV: 190nm detecta enlaces peptídicos, también detecta ácidos carboxílicos, iones de amortiguadores y alcoholes. 280nm detecta tirosina y triptófano. Si hay mezcla con ácidos nucleícos, entonces medir proporción de absorción (A_280nm/A _260nm) porque ellos absorben a 260nm.
• Ninhidrina: detecta aminas primarias y amonio. A pH 5 y 100^oC el nitrógeno terminal es liberado para reaccionar con dos moléculas de ninhidrina y producir una sal de amonio-ninhidrina. Detecta > 0.1μmol proteína
• Biuret: detecta dos o mas enlaces peptídicos en medio alcalino por reacción de iones de cobre con los nitrógenos de los enlaces peptídicos. Iones de amonio interfieren. Detecta 1 a 20 mg proteína.
• Xantoproteínica: detecta el grupo fenílico (-C₆H₅) de tirosina y triptófano por reacción con el ácido nítrico.
• Lowry: modificación de Biuret. El producto de Biuret (proteína-Cu⁺⁺) reduce la sal de fosfomolibdotungsteno (reactivo de Folin) aumentando 100 veces la sensibilidad de la prueba. Detecta de 20-400 μg/ml.
• Bradford: Las cargas positivas de las proteínas se unen a las cargas negativas del colorante azul brillante G-250 de Coomassie. El colorante en solución es de color rojo y al unirse a las cargas positivas de las proteínas cambia a color azul. Tiene poca interferencia con otros compuestos. Es la prueba más usada actualmente para la cuantificación de proteínas.
• Millon, Hopkins-Cole,
• Determinación de grupos sulfidrilo: Ellman,
• Determinación de nitrógeno: Kjeldahl,

2. Cromatografía en capa delgada: cualitativa. (reacción en calor)

Ninhidrina: puntos azules, prolina da amarillo. Pauly: tirosina e histidina, puntos de naranja a rojo. Sakaguchi: arginina, puntos rosados. Ehrlich: triptófano, puntos violeta

VALORES NUTRITIVOS DEL HUEVO

Por 100 g de alimento (Parte comestible):

• Huevo entero: 12,4g proteína; 11,1g grasa; 1,5g carbohidratos; 55mg Ca; 200mg P; 2,8mg Fe

• Clara: 10,8g proteína; 0,2g grasa; 0,6g carbohidratos; 7mg Ca; 16mg P; 0,2mg Fe

• Yema:16,1g proteína; 31,6g grasa; 1,2g carbohidratos;145mg Ca; 550mg P; 6,8mg Fe

Proteinas en la clara de huevo:

• ovalbumina: ~54%, glicoproteina, estructura de la clara, ~45000Da, pI 4.7, albumina
• ovotransferrina: ~13%, glicoproteina, transporte de hierro y antimicrobiana, ~78000Da, albumina
• lysozima: ~3.5%, antimicrobiana, ~14600Da,pI 11.1, albumina
• ovomucina: ~1.5%, glicoproteína, estructura de la clara
  

Secuencia de amino ácidos de la lisosima de gallina

>gi45384212refNP_990612.1 lysozyme [Gallus gallus]

MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCVAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMSAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL

Pi= 9.4   pm 16240 Da

TAREA: DETERMINAR EL PUNTO ISOELECTRICO DE CADA PEPTIDO

1. MRSLLILVLCF
2. LPLAALGKVFG
3. RCELAAAMKRH
4. GLDNYRGYSLG
5. NWVCVAKFESN
6. FNTQATNRNTD
7. GSTDYGILQIN
8. SRWWCNDGRTP
9. GSRNLCNIPCSA
10. LLSSDITASVN
11. CAKKIVSDGNGM
12. SAWVAWRNRCKG
13. TDVQAWIRGCRL

Práctica 1: Pi de la caseína

Proteínas en la leche de vaca:

• Caseínas (caseína-kappa, caseína-beta, caseína-alfa-S1 y caseína-alfa-S2),
• Proteínas del suero (lactoglobulina-beta, lactalbumina-alfa, lactotransferrina),
• Proteinasas (plasmin)

Abundancia según electroforesis:

1. caseína-alfa-S1 y caseína-beta ~80%
2. lactoglobulina-beta
3. caseína-kappa
4. caseína-alfa-S2
5. lactalbumina-alfa

Caseínas:

• Proteínas globulares pequeñas altamente modificadas (glucosiladas y/o fosforiladas) después de la traducción, generando isoformas.
• Estructura secundaria no conocida, sin embargo parece tener dominios hidrofobicos e hidrofilicos, también parece tener conformación abierta y flexible formado una red que le permite unirse al fosfato de calcio y así controla la no precipitación de la sal. La red de caseínas forma las micelas de caseína.
• Micelas de caseína:

1. capa superficial de las micelas: caseína-kappa (glicosilada),
2. interior de micelas: caseínas fosforiladas; caseína-alfa-S2, caseína-alfa-S1 y caseína-beta. Los grupos anionicos de los residuos polares, especialmente fosfoseriles son los sitios primarios de la unión con el fosfato de calcio, el cual es insoluble. Especialmente la caseína B, la cual determina el nivel de calcio en la leche.

Plasmin

Hidroliza los residuos de los puntos más flexibles (vueltas o uniones entre dominios hidrofílico-fidrofóbico) produciendo caseína-gama (hidrofóbica) y péptidos polares. En queso se adicionan proteinasas (quimosin, quimotripsina, tripsin, pepsina, enzimas intestinales) para liberar los grupos polares y aumentar la hidrofobicidad e inducir la coagulación de las micelas.

Proteínas del suero

• Lactoferrina: transporte de hierro. Pi ~8.8
• Lactalbumina-alfa: interactua con galactosil transferasa para atrapar glucosa y producir lactosa (glu, gal). Pi ~4.1
• Lactoglobulina-beta: posiblemente transporta pequeñas moléculas hidrofóbicas. Pi ~5

Articulo de referencia: punto isoeléctrico de la caseína