corrección tarea cromatografía de intercambio iónico

Responda las primeras siete preguntas con base en la práctica de cromatografía de intercambio iónico realizada en el laboratorio.

1 Cuál es el fundamento de la reacción de ninhidrina? Escriba la reacción de la ninhidrina con el ácido glutámico e histidina y diga a qué se debe el color en la reacción? (indíquelo en la reacción)

2 Cómo se obtiene el amortiguador de fosfato 67mmol/l pH 6,8? Realice cálculos y ecuación

Respuesta:

Guiándose por lo expuesto en los materiales y métodos de la guía, lo primero es determinarla concentración en mmol/L de las sales de KH₂PO₄ y Na₂HPO₄-2H₂O, entonces:

(9,08g KH₂PO₄ / 1L) (1g-mol KH₂PO₄ / 136,1g KH₂PO₄)= 66,72mmol/L de KH₂PO₄

(11,88g Na₂HPO₄-2H₂O / 1L) ( 1g-mol Na₂HPO₄-2H₂O / 178g Na₂HPO₄-2H₂O) = 66,74mmol/L Na₂HPO₄-2H₂O

Ya que la concentración de las soluciones madre es igual a la deseada, es necesario saber las proporciones de las dos sales para tener un equilibrio a 67mmol/L pH 6,8

primero se escriben las ecuaciones:

H₃PO₄ pKa1 = 2,14; pKa2 = 6,86; pKa3 12,4

la disociación que se utilizara será la del segundo pKa (6,86)

H₃PO₄ ----------- > H₂PO₄^-1 ------- > HPO₄^-2

se busca que estén en equilibrio [ HPO₄^-2] / [ H₂PO₄^-1]

el equilibrio será dado por las sales [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄]

como las sales provienen de dos bases fuertes entonces se disociaran completamente generando los dos iones de interés, para saber las proporciones que se deben adicionar de cada sal se usa la ecuación de Henderson-Hasselbalch,

6,8 = 6,86 + log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄]

log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 6,8-6,86

log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = -0,06

[ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 10^-0,06 (antilogaritmo)

[ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 0,87

eso indica que por 1 parte de [ KH₂PO₄] hay 0,87 partes de [ Na₂HPO₄-2H₂O]

sumando las dos partes hay en total 1,87, ese total es el 100%, así podemos saber el porcentaje de cada sal. entonces, 53,47% de [ KH₂PO₄] y 46,52% de [ Na₂HPO₄-2H₂O], eso quiere decir que se toman 53,47ml de [ KH₂PO₄] y 46,52ml de [ Na₂HPO₄-2H₂O] para un volumen total de 100ml. Este resultado muestra una diferencia con la guía, es posible que la guía haya usado un valor de pKa diferente y de allí las diferencias, el pKa que usamos aquí es el reportado en la Bioquímica de Matthews (pag 46).

3 Cuál es la proporción de las cargas netas de cada amino ácido a pH 6,8?

Respuesta:

Para conocer las proporciones de las cargas se aplica de nuevo la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

Para la histidina:

pH = pKa + log [H₃N⁺---C---(R)---COO^-] / [H₃N⁺---C---(R⁺H)---COO^-], vamos a llamar “T” a toda la parte del logaritmo para no tener que escribir eso tan largo cada vez.

pH = pKa + logT

logT = pH - pKa

logT = 6,8 – 6

logT = 0,8

T = 10^0,8

T = 6,31

eso indica que por 1 parte de la histidina con el radical protonado (denominador) hay 6,31 partes de la histidina con el radical sin protonar. Sumando estas dos partes hay un total de 7,31 partes y eso es el 100%.

sacando los porcentajes tenemos que hay 86,32% de la histidina con el radical sin protonar, o sea 86,32% esta con carga neta de cero. y 13,68% de la histidina tiene el radical protonado, o sea 13,68% esta con carga neta de +1.

Para el acido glutámico:

se soluciona igual, entonces

pH = pKa + log [H₃N⁺---C---(R^-)---COO^-] / [H₃N⁺---C---(R)---COO^-],vamos a llamar la parte de logaritmo como “W”,

pH = pKa + logW

logW = pH – pKa

logW = 6,8 – 4,2

logW = 2,6

W = 10^2,6 (antilogaritmo)

W = 398,11

eso quiere decir que por cada parte de acido glutámico con el radical sin ionizar (denominador) hay 398,11 partes del acido glutámico con el radical ionizado. Sumando las partes tenemos un total de 399,11 partes y eso es el 100%, asi podemos saber el porcentaje de las dos formas. entonces, 99,75% del acido glutámico tiene el radical ionizado, es decir el 99,75% del acido tiene carga neta -1, mientras que el 0,25% es del acido glutámico con el radical sin ionizar, o sea el 0,25% del acido tiene una carga neta de cero.

4 Qué pH tiene la columna después de adicionar el hidróxido de sodio 0,1mol/l?

Respuesta:

Primero hay que determinar el pH de la solución de NaOH 0,1mol/l

0,1mol NaOH ------ > 0,1mol Na⁺ + 0,1mol OH^-

pOH = -log [OH^-]

pOH = -log 0,1

pOH = 1

pH = 14 – pOH

pH = 14 – 1

pH = 13

desde el momento de adicionar el NaOH 0,1 mol/l el pH empezara a aumentar de 6,8, al final de pasar 2 o mas volúmenes de NaOH 0,1 mol/l la columna tendrá un pH de 13 aproximadamente.

5 Por qué la histidina es retenida por la resina a pH 6,8?

Respuesta:

Porque parte de la histidina esta cargada positivamente e interactua con el intercambiador cationico de la columna.

Nota: el pI de la histidina es de 7,6, por debajo de su pI la carga neta será positiva y por arriba del pI las cargas netas son negativas. Entre mas alejado este el pH del pI mayor serán las cargas positivas o negativas. Para retener amino ácidos o proteínas es recomendable hacerlo una unidad por arriba o abajo del pI para que después sea fácil liberarlo de la resina. Como estamos usando una resina de intercambio cationico, o sea que las moléculas cargadas positivamente van a desplazar a los iones de sodio de la resina, la histidina cargada positivamente interactuara con la resina. Entonces la histidina a pH 6,8 esta casi una unidad por debajo de su pI, una parte esta cargada positivamente (~13,68%) y la otra parte tendrá cargada neta cero. la hisitidina al correr por la columna puede estar cambiando en un rango de carga positiva de 13,68% a mas, las cargas de las moléculas no son estáticas y pueden tener pequeños cambios al correr por la columna, y eso hace que al final casi toda la histidina interactúe con la resina de intercambio cationico.

6 Por qué el ácido glutámico no es retenido por la resina a pH 6,8?

El pI del ácido glutámico es de 3,2 a pH de 6,8 la mayoría del ácido se encuentra con carga neta negativa y no interactúa con la resina intercambiadora de cationes.

7 Por qué la histidina es liberada cuando aumenta el pH de la columna?

Porque al aumentar el pH, las cargas netas de la histidina cambiaran a cero y luego serán negativas, eso hará que no haya interacción con la resina de intercambio cationico y la histidina se libera.

8 Se desea conocer la cantidad de amino acidos presentes en la proteína R. La proteína R es: i)una globulina citoplasmática presente en las raíces de las plantas de cacao; ii) es glucosidasa, hidroliza glucosa de la pared celular; iii) su pm es 38.000Da; iv) su pI es 6,3.

Para purificar la enzima se realizó un cultivo de las células de las raíces de cacao, después de su crecimiento las células se recogieron por filtración, las células en el papel de filtro fueron maceradas en un amortiguador de fosfato pH 7 a 4^oC. El macerado fue centrifugado para remover los detritos, el sobrenadante fue llevado a un pH de 6,3 y saturado 50% con una solución saturada de sulfato de amonio, el precipitado fue disuelto en agua y dializado contra agua por dos días a 4^oC. El dializado fue adicionado a una columna cromatográfica de exclusión, la fracción con actividad de glucosidasa y peso correspondiente a 38.000Da fue hidrolizada en acido a 100^oC por 3 horas.

El producto de la hidrólisis acida fue adicionado a una columna con intercambiador catiónico (Dowex AG 50 W-X2, el intercambiador es el ácido sulfónico en forma de sal sódica SO3^-Na⁺). El amortiguador fosfato de sodio fue usado para eluir la columna. La elución empezó a un pH de 3 y el amortiguador fue cambiando cada 3 volúmenes a pH de 3,5 / 4 / 4,5 / 5 / 5,5 / 6 / 6,5 / 7

Dibuje el perfil de elusión de los amino ácidos, asuma que los 20 amino ácidos se encuentran libres en el producto de la hidrólisis ácida. Indique en el perfil el pH usado para la elución.

Nota: para hacer el ejercicio es necesario saber la carga neta de cada amino ácido a cada pH de elución.

Respuesta:

los amino ácidos serán eluidos en el siguiente orden:

1 ácido aspartico

2 ácido glutámico

3 asparagina

4 fenilalanina

5 glutamina

6 serina

7 metionina

8 triptofano

9 glicina

10 valina

11 leucina

12 alanina

13 isoleucina

14 prolina

15 treonina

16 histidina

17 lisina

18 cisteina

19 tirosina

20 arginina

Respuesta ejercicios amortiguadores

Primer ejercicio

La actividad enzimática máxima de la enzima T es a un pH de 8, qué amortiguador podría usar para esta reacción? Realice los cálculos para obtener 500ml del amortiguador seleccionado a una concentración de 150mmol/l.

Respuesta:

Ya que la actividad máxima de la enzima es a un pH de 8, podían utilizar cualquier sal cuyo acido o base conjugada tuviese un pKa cercano a 8, por ejemplo: el ácido pirofosfórico pKa4 = 8,22; el ácido fosfórico pKa2 = 7,21; ion amonio pKa = 9,25

El cálculo lo podían hacer con cualquiera de ellos, vamos a tomar el ácido pirofosfórico para el ejercicio.

El primer paso es establecer la sal, entonces tomaremos pirofosfato de sodio.

Segundo, escribir la ecuación:

H₄P₂O₇ < ------ > H₃P₂O₇^-1

H₃P₂O₇^-1 < ------ > H₂P₂O₇^-2

H₂P₂O₇^-2 < ------- > HP₂O₇^-3

HP₂O₇^-3 < ----- > P₂O₇^-4 pKa 8,22

Entonces,

150mmol H₄P₂O₇ + 600mmol NaOH ------ > 150mmol Na₄P₂O₇ + 600mmol H₂O

150mmol Na₄P₂O₇ < ----- > 150mmol P₂O₇^-4 + 600mmol Na⁺

Tercero, escribir la ecuación de Henderson-Hasselbalch

pH = pKa + (log[P₂O₇^-4] – log [H₄P₂O₇])

entonces,

8 = 8,22 + log 150mmol/L – log [H₄P₂O₇]

log [H₄P₂O₇] = 8,22 + 2,18 -8

log [H₄P₂O₇] = 2,40

[H₄P₂O₇] = 10^2,40 (antilogaritmo)

[H₄P₂O₇] = 251,2 mmol/L

Cuarto, determinar cuánto tomar de las soluciones madre de H₄P₂O₇ y NaOH

V1 = (V2 * C2 ) / C1

V1 H₄P₂O₇ = (500ml * 251,2mmol/L) / 1500mmol/L

V1 H₄P₂O₇ = 83,73ml

V1 H₄P₂O₇ = (500ml * 150mmol/L) / 1500mmol/L

V1 H₄P₂O₇ = 50ml

Total H₄P₂O₇ = 133,73ml

V1 NaOH = (500ml * 600mmol/L ) / 1500mmol/L

V1 NaOH = 200ml

Finalmente, se plantea cómo se haría el amortiguador:

Se mezclan 200ml de NaOH, 133,73ml de H₄P₂O₇ y se lleva hasta 500ml con agua destilada, confirmar el pH con potenciómetro.

Segundo ejercicio

La actividad enzimática máxima de la enzima R es a un pH de 5, realice una solución amortiguadora de propionato de sodio 200mmol/l pH5 para la reacción enzimática.

Respuesta:

Este ejercicio se resuelve igual al anterior. pKa del ácido propiónico 4,87 (CH₃CH₂COOH).
podían tomar cualquier volumen final, para un litro la cantidad de ácido adicionado es 232ml y de base 133,33ml

Tercer ejercicio

La enzima M fue aislada de hígado de ratón, la actividad máxima de la enzima es a pH 3,5. Realice los cálculos para obtener un amortiguador a ese pH usando ácido láctico. La concentración de la sal debe ser de 50mmol/l en 150ml de solución amortiguadora.

Respuesta:

Este ejercicio se resuelve igual al anterior. pKa del ácido láctico 3,86 (CH₃CHOHCOOH).

Para formar la sal podían usar KOH o NaOH. Cantidad de ácido adicionado 16,48ml, cantidad de base 5ml.

Cuarto Ejercicio

La actividad máxima de la enzima Q es a un pH de 12, realice un amortiguador de fosfato 250mmol/l en 300ml a ese pH.

Respuesta:

Este ejercicio se puede resolver igual al anterior. pKa3 del acido fosfórico 12,3 (H₃PO₄)

H₃PO₄ + KOH -------- > KH₂PO₄

KH₂PO₄ ------ > K₂HPO₄

K₂HPO₄ ----- > K₃PO₄

Entonces globalizando la ecuación:

H₃PO₄ + 3 KOH -------- > K₃PO₄ + 3H₂O

250mmol H₃PO₄ + 750mmol KOH -------- > 250mmol K₃PO₄ + 750 H₂O

250mmol K₃PO₄ ------ > 250mmol PO₄^-3 + 750mmol K⁺

Escribiendo la ecuación de Henderson-Hasselbalch:

12 = 12,3 + log 250 – log [H₃PO₄]

log [H₃PO₄] = 2,7

[H₃PO₄] = 10^2,7

[H₃PO₄] = 501,2 mmol/L

Determinar los volúmenes a tomar de las soluciones madre a 1500mmol,

V1 [H₃PO₄] = (300ml * 501,2 mmol/L) / 1500mmol/L

V1 [H₃PO₄] = 100,24ml

V1 [H₃PO₄] = (300ml * 250 mmol/L) / 1500mmol/L

V1 [H₃PO₄] = 50ml

Volumen total de ácido 150,24ml

V1 KOH = (300ml * 750 mmol/L) / 1500 mmol/L

V1 KOH = 150ml

El amortiguador se hara mezclando 150ml de KOH y 150,24ml de H₃PO₄ para un volumen final de 300,24ml

Nota: La sal K₃PO₄ se forma con 150ml de KOH y 50ml de H₃PO₄ el amortiguador a pH 12 se dará con los 100,24ml de más de ácido.

Quinto ejercicio

Realice los cálculos para obtener un amortiguador de carbonato para la enzima Y cuya máxima actividad enzimática es a un pH de 9,5. Realice 400ml de amortiguador a una concentración de 70mmol/l.

Respuesta:

pKa2 del ácido carbónico 10,25 (H₂CO₃). Cantidad de ácido adicionado 122,41ml. Cantidad de base adicionada 37,33ml.

NOTA GENERAL

Recuerden que los amortiguadores también se pueden hacer con una sal que ya viene comercial y la adición de su correspondiente ácido o base débil. En estos ejercicios, todos fueron resueltos con la adición de un ácido débil y una base fuerte por separado para formar la sal en la solución, y con un exceso de ácido para lograr el amortiguador.

Tarea cromatografía de intercambio iónico

Responda las primeras siete preguntas con base en la práctica de cromatografía de intercambio iónico realizada en el laboratorio.

1) Cuál es el fundamento de la reacción de ninhidrina? Escriba la reacción de la ninhidrina con el ácido glutámico e histidina y diga a qué se debe el color en la reacción? (indíquelo en la reacción)

2) Cómo se obtiene el amortiguador de fosfato 67mmol/l pH 6,8? Realice cálculos y ecuación

3) Cuál es la proporción de las cargas netas de cada amino ácido a pH 6,8?

4) Qué pH tiene la columna después de adicionar el hidróxido de sodio 0,1mol/l?

5) Por qué el ácido glutámico no es retenido por la resina a pH 6,8?

6) Por qué la histidina es retenida por la resina a pH 6,8?

7) Por qué la histidina es liberada cuando aumenta el pH de la columna?

8) Se desea conocer la cantidad de amino ácidos presentes en la proteína R. La proteína R es: i)una globulina citoplasmática presente en las raíces de las plantas de cacao; ii) es glucosidasa, hidroliza glucosa de la pared celular; iii) su pm es 38.000Da; iv) su pI es 6,3.

Para purificar la enzima se realizó un cultivo de las células de las raíces de cacao, después de su crecimiento las células se recogieron por filtración, las células en el papel de filtro fueron maceradas en un amortiguador de fosfato pH 7 a 4^oC. El macerado fue centrifugado para remover los detritos, el sobrenadante fue llevado a un pH de 6,3 y saturado 50% con una solución saturada de sulfato de amonio, el precipitado fue disuelto en agua y dializado contra agua por dos días a 4^oC. El dializado fue adicionado a una columna cromatográfica de exclusión, la fracción con actividad de glucosidasa y peso correspondiente a 38.000Da fue hidrolizada en acido a 100^oC por 3 horas.

El producto de la hidrólisis acida fue adicionado a una columna con intercambiador catiónico (Dowex AG 50 W-X2, el intercambiador es el ácido sulfónico en forma de sal sódica SO3^-Na⁺). El amortiguador fosfato de sodio fue usado para eluir la columna. La elución empezó a un pH de 3 y el amortiguador fue cambiando cada 3 volúmenes a pH de 3,5 / 4 / 4,5 / 5 / 5,5 / 6 / 6,5 / 7

Dibuje el perfil de elusión de los amino ácidos, asuma que los 20 amino ácidos se encuentran libres en el producto de la hidrólisis ácida. Indique en el perfil el pH usado para la elución.

Nota: para hacer el ejercicio es necesario saber la carga neta de cada amino ácido a cada pH de elución.

figuras cromatografía de exclusión molecular

CROMATOGRAFíA DE EXCLUSIóN MOLECULAR

BIBLIOGRAFIA

Amersham Bioscience. 2002. Gel filtration, principles and methods, Handbook. Edition 18-102218. hacer click aquí para acceder a éste documento

Ejercicios soluciones amortiguadoras

Para los siguientes problemas parta de soluciones madres de 1,5mol/l. Los pKa de los ácidos los encuentran en la bioquímica de Lehninger y en la Bioquímica de Mathew.

1) La actividad enzimática máxima de la enzima T es a un pH de 8, qué amortiguador podría usar para esta reacción? Realice los cálculos para obtener 500ml del amortiguador seleccionado a una concentración de 150mmol/l.

2) La actividad enzimática máxima de la enzima R es a un pH de 5, realice una solución amortiguadora de propionato de sodio 200mmol/l pH5 para la reacción enzimática.

3) La enzima M fue aislada de hígado de ratón, la actividad máxima de la enzima es a pH 3,5. Realice los cálculos para obtener un amortiguador a ese pH usando ácido láctico. La concentración de la sal debe ser de 50mmol/l en 150ml de solución amortiguadora.

4) La actividad máxima de la enzima Q es a un pH de 12, realice un amortiguador de fosfato 250mmol/l en 300ml a ese pH.

5) Realice los cálculos para obtener un amortiguador de carbonato para la enzima Y cuya máxima actividad enzimática es a un pH de 9,5. Realice 400ml de amortiguador a una concentración de 70mmol/l.

Soluciones amortiguadoras

Para preparar una solución amortiguadora se tiene en cuenta el pH al que se necesita. En el caso de las enzimas, el amortiguador se usa al pH de la máxima actividad enzimática. Para garantizar que el pH se mantenga y que pequeños cambios en la concentración de H⁺ o OH^- (liberados en las reacciones químicas o enzimáticas) no afecten el pH, se usan amortiguadores con un pKa cercano al pH de la máxima actividad de la enzima. Además del pKa es necesario tener en cuenta que el amortiguador no sea toxico en la reacción, que sea estable y que se disuelva en agua fácilmente.

Para preparar un amortiguador siempre se necesita la sustancia amortiguadora en forma de sal y su respectivo ácido o base débil (conjugada); o dos sales que al disociarse generen el sistema amortiguador.

Hay varias formas para preparar una solución amortiguadora:

1 Se pesan las dos sales por separado y se disuelven en agua

2 Se pesan la base y ácido por separado para formar la sal se disuelve en agua y luego se adiciona un ácido o una base fuerte.

Ejemplo de los dos métodos para preparar soluciones amortiguadoras,

1 Problema; preparar 1L de 0,5mol/l amortiguador fosfato pH7,5

a) Determinar el componente principal del sistema amortiguador, esto no es problema con un acido monoproteico (ácido acético CH3COOH), sin embargo con los sistemas diproticos (H2PO4-) o poliproticos (H3PO4) el somponente cambia dependiendo del ph deseado.

En éste caso el sistema será H2PO4^-/HPO4^-2 porque su pKa es de 7,21. El sistema H3PO4/H2PO4- tiene un pKa de 2,12 y el sistema HPO4^-2/PO4^-3 tiene un pKa de 12,3; estos valores son muy altos o muy bajos para el amortiguador que deseamos preparar (pH 7,5) y ninguno de los dos será un buen amortiguador a pH 7,5.

b) después de definir los componentes se escribe la ecuación de equilibrio y se identifica el par de ácido o base conjugado:

H2PO4^- <-------> HPO4^-2 + H⁺ pKa 7,21

c) se calcula la proporción deseada de ácido y base a partir de la ecuación de Henderson-Hasselbalch

pH = pKa + log [HPO4^-2] – log [H2PO4^-]

log [H2PO4^-] - log [HPO4^-2] = 7,21 – 7,5

-1 (log [H2PO4^-] - log [HPO4^-2]) = -1 ( 7,21 – 7,5)

log [HPO4^-2] - log [H2PO4^-] = 7,5-7,21

log [HPO4^-2] - log [H2PO4^-] = 0,29

[HPO4^-2] / [H2PO4^-] = 10^0,29 (antilogaritmo)

[HPO4^-2] / [H2PO4^-] = 1,95

Esto significa 1,95 partes de [HPO4^-2] por 1 parte de [H2PO4^-], osea un total de una parte de 2,95. Con este total (2,95) se puede calcular el porcentaje de cada compuesto:

% HPO4^-2 = (1,95 / 2,95) x 100 = 66.2%

%H2PO4^- = (1 / 2,95) x 100 = 33,8%

d) Calcular cuánto se pesa de cada uno en forma de sal para obtener las soluciones de K2HPO4 y de KH2PO4. Estas sales en solución se ionizan completamente y darán los dos componentes del amortiguador.

Necesitamos el 66,2% de 1 mol de K2HPO4 y 33,8% de 1 mol de %KH2PO4 para 1 L, entonces:

(66,2% x 1 mol) / 100% = 0,662 mol de K2HPO4 y (33,8% x 1 mol ) / 100% = 0,338 mol de KH2PO4. Como las soluciones deben tener 0,5 mol/L (mirar enunciado), entonces:

(0,662 mol x 0,5 L) / 1L = 0,331 mol de K2HPO4 en 0,5L de agua y,

(0,338 mol x 0,5 L ) / 1L = 0,169 mol de KH2PO4 en 0,5L de agua

Para saber cuánto en gramos es:

(0,331 mol x 174,2g/mol) / 1 mol = 57,7g de K2HPO4

(0,169 mol x 136,1 g/mol) 1mol = 23g de KH2PO4

e) Para preparar el amortiguador, pesar 23 g de KH2PO4 y 57,7g de K2HPO4 y disolver hasta mas o menos 750ml de agua destilada. Comprobar el pH con un potenciómetro y ajustar con ácido o base si es necesario, finalmente completar hasta 1L con agua destilada.

2) Segunda forma de preparar el amortiguador:

Esta es la forma del enunciado del parcial.

Tenga en cuenta que en el enunciado anterior se dice 0,5 mol/l del amortiguador fosfato, no 0,5 mol/l de la sal fosfato de potasio, la concentración se refiere al sistema fosfato. Si el enunciado dice preparar un amortiguador 0,1mol/l de acetato de potasio, esta concentración se está refiriendo a la concentración de la sal y necesita determinar los componentes de la sal, en este caso es el ácido acético y el hidróxido de potasio.

Realice los cálculos para obtener 200ml de acetato de potasio 100 mmol/l pH5 a partir de soluciones madre 1mol/l de ácido acético y 1mol/l de hidróxido de potasio. Pka del ácido acético 4,76

a) Escribir la ecuación de la mezcla de las dos soluciones para obtener la sal, se necesita una sal de 0,1mol:

0,1mol CH3COOH + 0.1mol KOH <--------> 0,1mol CH3COOK + H2O

0,1mol CH3COOK <------> 0,1mol CH3COO^- + 0.1mol K⁺

b) Ya sabe la concentración del ion acetate, ahora necesita la concentración del ácido acético, para hallarla utiliza la ecuacion de Henderson-Hasselbalch:

pH = pKa + log [CH3COO^-] - log [CH3COOH]

log [CH3COOH] = pKa – pH + log [CH3COO^-]

log [CH3COOH] = 4,76 – 5 + log 0,1

log [CH3COOH] = -1,24

[CH3COOH] = 10^-124 (antilogaritmo)

[CH3COOH] = 0,057 mol/l

c) Ya sabe la concentración de los componentes que forman la sal y la cantidad de ácido acético de más para obtener el amortiguador acetato de potasio 0,1mol/l pH 5. Necesita hacer los cálculos para saber cuánto tomar de las soluciones madres:

V1 = (200ml x 01,mol/l ) / 1mol/l KOH = 20ml de de 1mol/l KOH

V1= (200ml x 01,mol/l ) / 1mol/l CH3COOH = 20ml de de 1mol/l CH3COOH

V1 = (200ml x 0,057 mol/l) 1mol/l CH3COOH = 11,4ml de 1mol/l CH3COOH

Entonces;

Mezclar 20 ml de 1mol/l KOH con 31,4ml de CH3COOH llevar hasta 180ml con agua destilada, verificar el pH (si es necesario cuadrar con KOH o CH3COO), posteriormente llevar hasta 200ml con agua destilada .

La sal se formara a partes iguales del ácido y la base y el ácido restante hará parte de la amortiguación a pH 5.

Bibliografía:

Bohinski Robert. 1987. Modern Concepts in Biochemistry. Chapter 2: Noncovalent bonding and pH buffering. Fifth Edition. Woodstock Publishers' Services. USA.

Corrección del 3er quiz 6 de noviembre

lo que esta en paréntesis no tenían que escribirlo, es explicación

1) En cada paso se debe cuantificar las proteínas por prueba de Biuret o xantoproteica o Lowry o Bradford. Hacer seguimiento de la purificación por electroforesis, determinar actividad enzimático
a) Tomar hojas jóvenes
b) romper células
c) separar detritos de citoplasma
d) tomar el citoplasma
e) hacer salting out a 50%, las globulinas precipitan mas o menos a esa saturación de sal
f) separar el precipitado
g) resuspender el precipitado en agua y limpiar por diálisis
h) realizar cromatografía del dializado (para purificar la proteína T ya que en el citoplasma pueden haber numerosas globulinas)
1. cromatografía de exclusión molecular (que separe ejemplo de 5000 a 20000Da)
2. cromatografía de intercambio iónico (pI 8)
3. cromatografía de afinidad (glucosidasa)
i) verificar pureza con electroforesis, determinar % de rendimiento y actividad de la enzima

2)
En la prueba de Bradford la cargas positivas de las proteínas se unen a las cargas negativas del colorante azul brillante de Coomassie. El colorante en solución es de color rojo y al unirse con las cargas positivas de las proteínas cambia a color azul.

3)
la prueba de Biuret determina enlaces peptídico por reacción en medio alcalino de iones de cobre con los nitrógenos de los enlaces peptídico. La prueba de Lowry es una modificación de la prueba de Biuret, en la que el producto de la prueba de Biuret (proteína-cobre) reduce el reactivo de folin, esto aumenta 100 veces la sensibilidad.

4)
a)
-una parte es reflejada
-otra parte es absorbida por las moléculas de la sustancia
-otra parte es transmitida a través de la solución

b) las moléculas en una solución de color violeta adsorben en la longitud de onda del color opuesto al violeta. El color opuesto del violeta es el naranja que tiene una longitud de onda de aproximadamente 600 a 650nm, en este rango se puede determinar la concentración de las moléculas en la solución violeta.

5)
Solución madre al 30% de albúmina bovina. curva de calibración con concentraciones (ejemplo) 2,3,5,7,10mg/l

a) convertir la concentración de 30% a mg/l
1000ml -100%
X 30%
X= (30% x 1000ml) / 100%
X = 300ml=300g en 1L = 300000mg/l

b) diluciones en serie
1ml de solución madre + 9ml de agua = dilución 1/10 concertación del tubo 30000mg/l
1ml de 1/10 + 9ml de agua = dilución 1/100 concentración del tubo 3000mg/l
1ml de 1/100 + 9ml de agua = dilución 1/1000 concentración del tubo 300mg/l
1ml de 1/1000 + 9ml de agua = dilución 1/10000 concertación del tubo 30mg/l

c) a partir del ultimo tubo se pueden hacer las patrones de la curva de calibración

V1 = (1ml x 10mg/l) / 30mg/l = 0.333ml + 0.667ml de agua

V1 = (1ml x 7mg/l) / 30mg/l = 0.233ml +0.767ml de agua

V1 = (1ml x 5mg/l) /30mg/l = 0.166ml +0.834ml de agua

V1 = (1ml x 3mg/l) / 30mg/l = 0.1ml +0.9ml de agua

V1 = (1ml x 2mg/l) /30mg/l = 0.066ml +0.934ml de agua

Corrección del 3er quiz 6 de noviembre

I) lo que esta en paréntesis no tenían que escribirlo, es explicación
1) En cada paso se debe cuantificar las proteínas por prueba de Biuret o xantoproteica o Lowry o Bradford. Hacer seguimiento de la purificación por electroforesis, determinar actividad enzimático
2) Tomar hojas jóvenes
3) romper células
4) separar detritos de citoplasma
5) tomar el citoplasma
6) hacer salting out a 50%, las globulinas precipitan mas o menos a esa saturación de sal
7) separar el precipitado
8) resuspender el precipitado en agua y limpiar por diálisis
9) realizar cromatografía del dializado (para purificar la proteína T ya que en el citoplasma pueden haber numerosas globulinas)
1. cromatografía de exclusión molecular (que separe ejemplo de 5000 a 20000Da)
2. cromatografía de intercambio iónico (pI 8)
3. cromatografía de afinidad (glucosidasa)
10) verificar pureza con electroforesis, determinar % de rendimiento y actividad de la enzima
II)
En la prueba de Bradford la cargas positivas de las proteínas se unen a las cargas negativas del colorante azul brillante de Coomassie. El colorante en solución es de color rojo y al unirse con las cargas positivas de las proteínas cambia a color azul.

III)
la prueba de Biuret determina enlaces peptídico por reacción en medio alcalino de iones de cobre con los nitrógenos de los enlaces peptídico. La prueba de Lowry es una modificación de la prueba de Biuret, en la que el producto de la prueba de Biuret (proteína-cobre) reduce el reactivo de folin, esto aumenta 100 veces la sensibilidad.

IV)
1)-una parte es reflejada
-otra parte es absorbida por las moléculas de la sustancia
-otra parte es transmitida a través de la solución
2) las moléculas en una solución de color violeta adsorben en la longitud de onda del color opuesto al violeta. El color opuesto del violeta es el naranja que tiene una longitud de onda de aproximadamente 600 a 650nm, en este rango se puede determinar la concentración de las moléculas en la solución violeta.

V)
Solución madre al 30% de albúmina bovina. curva de calibración con concentraciones (ejemplo) 2,3,5,7,10mg/l
1) convertir la concentración de 30% a mg/l
1000ml -100%
X 30%
X= (30% x 1000ml) / 100%
X = 300ml=300g en 1L = 300000mg/l
2) diluciones en serie
1ml de solución madre + 9ml de agua = dilución 1/10 concertación del tubo 30000mg/l
1ml de 1/10 + 9ml de agua = dilución 1/100 concentración del tubo 3000mg/l
1ml de 1/100 + 9ml de agua = dilución 1/1000 concentración del tubo 300mg/l
1ml de 1/1000 + 9ml de agua = dilución 1/10000 concertación del tubo 30mg/l

a partir del ultimo tubo se pueden hacer las patrones de la curva de calibración

V1 = (1ml x 10mg/l) / 30mg/l = 0.333ml + 0.667ml de agua

V1 = (1ml x 7mg/l) / 30mg/l = 0.233ml +0.767ml de agua

V1 = (1ml x 5mg/l) /30mg/l = 0.166ml +0.834ml de agua

V1 = (1ml x 3mg/l) / 30mg/l = 0.1ml +0.9ml de agua

V1 = (1ml x 2mg/l) /30mg/l = 0.066ml +0.934ml de agua

Corrección del segundo quiz Octubre 30

1)
700ml – 100% de solución de KOH
X - 18%
X = (18% x 700ml) / 100%
X= 126ml = 126g de KOH hasta 700ml de solvente

(126g KOH / 700ml) x (1mol KOH / 56g) x (1000ml / 1L) = 3.21mol KOH/l

En 200ml de la solución, la concentración es la misma (18% 0 3.21mol KOH/l), porque no se esta adicionando agua o concentrando la solución.

2) El objetivo de este punto era evaluar su capacidad para plantear un experimento lógicamente, la nota se baso en si el estudiante tenia una idea correcta de como plantea el experimento

a)disolver la proteína en la base fuerte (NaOH)
b)formar un amortiguador con el acido débil (acido carbónico) y la base fuerte (NaOH)
c)Calcular cuanto hay que adicionar del acido para obtener un pH de 7
Entonces:
a) Soluciones de NaOH y H2CO3 con concentraciones en igual proporción, podía escoger cualquiera, por ejemplo: 1mol/l. Entonces, disolver la proteína en NaOH 1mol/l. Mezclar la solución álcali de la proteína con el acido a una concentración final de 0.1mol/l de NaOH y H2CO3 para formar el amortiguador.

V1 = (100ml x 0.1mol/l) / 1mol/l = 10ml

entonces: 10ml de solución proteica en NaOH 1mol/l mas (+) 10ml de H2CO3 1mol/l mas 80ml de agua.
reacciones: 0.1mol H2CO3 con 0.1 mol de NaOH produce 0.1mol Na2CO3 el cual va a estar disociado completamente como 0.1mol Na2 + 0.1mol CO3.

Para llevar el tubo a pH 7 entonces mezclar en un tubo (Vf, 10ml por ejemplo) la proteína en Na2CO3 con una concentración determinada de H2CO3.
como se llevo a un Vf de 10ml entonces la concentración de proteína en Na2CO3 es por ejemplo de 0.01mol/l

V1 = (10ml x 0.01mol/l) / 0.1mol/l = 1ml de proteína en Na2CO3 0.1mol/l

c) Para determinar cuanto se debe adicionar de H2CO3 se utiliza la ecuación de
pH = pKa + log[CO3]/[H2CO3],
entonces: pH = pKa + log[CO3] – log[H2CO3]
entonces despejando: log[H2CO3] = pKa – pH + log[CO3]
log[H2CO3] = 6.37 – 7 + log[CO3]
log[H2CO3] = -0.63 + log 0.01
log[H2CO3] = -2.63
[H2CO3] = 10^-2.63
[H2CO3] = 0.0023mol/l

Hay que adicionar H2CO3 a una concertación final de 0.023mol/l

V1 = (10ml x 0.0023mol/l H2CO3) / 0.01mol/l H2CO3 = 2.3ml de 0.01mol/l de H2CO3


Finalmente, adicionar en un tubo 6.7ml de agua + 1ml de solución proteica en 0.1mol/l Na2CO3 + 2.3ml de 0.01mol/l de H2CO3, pH de teórico de 7.

Resultado: se vera precipitación de la proteína T
Control negativo: la solución proteica en Na2CO3, debería mantenerse soluble sin precipitar.

3) Propiedades físico-químicas de las proteínas
-Solubilidad
-Masa/tamaño
-Carga

4)Biuret determina enlaces peptídico mientras que ninhidrina determina aminas primarias (grupo alfa-amino libre).

5) Podía mencionar dos de cualquiera de estas técnicas:
-Soluciones concentradas de sales (sulfato de amonio, cloruro de sodio, sulfato de sodio)
-Sales de metales pesados (Cloruro de mercurio, nitrato de plata, sulfato de cobre)
-Solventes orgánicos (acetona, alcohol)
-Ácidos (acido tricloroacetico, acido picrico)
-Polielectrolitos: polietilen-glicol
-iones (zinc, cobre, hierro, plomo, bario)
-pI solo para proteínas poco solubles en agua (caseina), si la proteína es soluble en agua (albumnina) debe haber complemento con saturación por sales (salting out)
- Calor solo a 80-95°C por poco tiempo (albumina), así quedan solubles las proteínas mas estables al calor

Práctica 3: Espectrofotometría

Enlaces covalentes: C-C (sigma), C=C (2π), C=C (1 sigma y 2 π)

• Al incidir una radiación electromagnética (luz), la energía del fotón puede ser absorbido por la molécula y los electrones sigma y π son excitados a un nivel de mayor energía en el mismo nivel:

• El grupo atómico responsable de la absorción de energía se llama cromóforo:

=C-C=, =C-, -O-, =C=O, -C=C-

Cada grupo cromóforo desplaza la absorción a una longitud de onda mayor, entre mas cromóforos más color tiene un compuesto.

• La longitud de onda que excita los electrones es específica para cada molécula, se llama coeficiente de extinción molar o coeficiente de absortividad molar.

• Cuando la luz blanca se descompone en sus diferentes longitudes de onda se forma el espectro electromagnético que va desde los rayos cósmicos a las ondas de radio:

longitud de onda ultra violeta: 10 – 400 nm, UV corta 10-200, UV larga 200-400 (el cuarzo no absorbe a esta longitud de onda)

longitud de onda visible: 400 – 780: violeta (400-430) <>

Colorimetría / espectrofotometría

• Cuando una radiación monocromática (obtenido por filtro, prisma o rendija) incide sobre una solución, parte de la energía es absorbida por las moléculas en la solución, parte es reflejada y parte es transmitida a través de la solución.
• La energía transmitida se llama tramitancia (T) y se puede determinar por una relación:

T =

Luz transmitida o potencia transmitida

---------------------------------------------------------

luz incidente o potencia incidente

T x 100% = % T

Absorbancia (A)= 2-log %T

Densidad Óptica (DO) = A a una determinada longitud de onda / l

l = es la distancia que la luz viaja a través de la muestra (grosor del tubo en el que se encuentra la muestra), generalmente 1cm.

A = e l c (ley de Lambert-Beer)

e= coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extinción molar,

c = concentración, si esta en g/L = coeficiente de extinción especifica o absortividad especifica. Si esta en mol/L = coeficiente de extinción molar o absortividad molar

Procedimiento para estandarización de un método espectrofotométrico

Fuente: hidrógeno o deuterio: 150 – 390nm; tungsteno o wolframio: 325 – 1500nm

1. Error fotométrico: menor al 20%T y mayor al 80%T, en los espectrofotometros modernos el error es menor del 15%T y mayor al 85%T.
2. Determinación de la longitud de onda de máxima absorción; concentración constante a diferentes longitudes de onda, se llama espectro de absorción.
3. Curva de calibración; diferentes concentraciones a una longitud de onda constante (la de máxima absorción obtenida del espectro de absorción).
4. Rango óptimo de concentración ; gráfica de %T vs log de la concentración, se llama Curva de Ringbom.

5. Determinar la concentración de las muestras:

   • Interpolación en la línea recta obtenida de A o DO vs concentración;
   ecuación de la linea recta: y = a + mx donde a es el punto donde se corta el eje Y; m es la pendiente de la recta.

   A = m (concentración)

   • Método del patrón: comparando la ecuación de la ley de Lambert-Beer para la muestra y el patrón.

   A muestra= e l [muestra]

_{A patrón} = e l [patrón]

Comparando:

A_patrón / A_muestra = e l [patrón] / e l [muestra]

entonces:

A_patrón / A_muestra = [patrón] / [muestra]

Práctica 2: Purifición y caracterización de proteínas

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PROTEÍNA

1) INFORMACIÓN SOBRE PROTEÍNA DE INTERÉS:

• Constitutiva o inducida, tejido o célula
• Intracelular o extracelular
• Unida a la membrana,
• Si es albumina o globulina o glutelina o prolamina,
• Solubilidad: sales, solventes orgánicos, polielectrolitos, sales de iones (Zn, Cu, Fe), policationes, ácidos
• Secuencia de amino ácidos: carga neta a diferentes pHs, pI, peso molecular,
• Modificada después de la traducción: fosforilada, glicosilada, hidrolisada
• Detección: enzima (detección substrato o producto), anticuerpo, proteína marcada (proteína verde fluorescente),absorbancia

no información, entonces, información de proteínas similares

2) PURIFICACIÓN

En cada paso de purificación:

Cuantificar proteínas (prueba de Biuret, xantoproteinica, lowry, Bradford, ninhidrina), observar pureza por electroforesis, actividad enzimática,% purificación y % recuperación

• Extracción: rompimiento de tejido o célula
• Precipitación
• Diferentes cromatografías: exclusión molecular, intercambio ionico, afinidad

3) CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNA PURA

Composición química: C,O,H,S; anillos fenolico, enlaces disulfuro,

• Secuenciación de amino ácidos,
• Cinética enzimática
• Cristalografia de rayos X,prediccion estructura secundaria, terciaria, cuaternaria

Detección de amino ácidos y proteínas:

Composición general: de C, N, H y S calentando proteína (C) en un tubo seco con papel tornasol (amoniaco) y acetato de plomo (S).

Determinación nitrógeno: Lassaigne

Determinación azufre

colorimétricamente por Absorbancia o por cromatografía en capa delgada

1. Absorbancia: cualitativa y cuantitativa

• Absorción UV: 190nm detecta enlaces peptídicos, también detecta ácidos carboxílicos, iones de amortiguadores y alcoholes. 280nm detecta tirosina y triptófano. Si hay mezcla con ácidos nucleícos, entonces medir proporción de absorción (A_280nm/A _260nm) porque ellos absorben a 260nm.
• Ninhidrina: detecta aminas primarias y amonio. A pH 5 y 100^oC el nitrógeno terminal es liberado para reaccionar con dos moléculas de ninhidrina y producir una sal de amonio-ninhidrina. Detecta > 0.1μmol proteína
• Biuret: detecta dos o mas enlaces peptídicos en medio alcalino por reacción de iones de cobre con los nitrógenos de los enlaces peptídicos. Iones de amonio interfieren. Detecta 1 a 20 mg proteína.
• Xantoproteínica: detecta el grupo fenílico (-C₆H₅) de tirosina y triptófano por reacción con el ácido nítrico.
• Lowry: modificación de Biuret. El producto de Biuret (proteína-Cu⁺⁺) reduce la sal de fosfomolibdotungsteno (reactivo de Folin) aumentando 100 veces la sensibilidad de la prueba. Detecta de 20-400 μg/ml.
• Bradford: Las cargas positivas de las proteínas se unen a las cargas negativas del colorante azul brillante G-250 de Coomassie. El colorante en solución es de color rojo y al unirse a las cargas positivas de las proteínas cambia a color azul. Tiene poca interferencia con otros compuestos. Es la prueba más usada actualmente para la cuantificación de proteínas.
• Millon, Hopkins-Cole,
• Determinación de grupos sulfidrilo: Ellman,
• Determinación de nitrógeno: Kjeldahl,

2. Cromatografía en capa delgada: cualitativa. (reacción en calor)

Ninhidrina: puntos azules, prolina da amarillo. Pauly: tirosina e histidina, puntos de naranja a rojo. Sakaguchi: arginina, puntos rosados. Ehrlich: triptófano, puntos violeta

VALORES NUTRITIVOS DEL HUEVO

Por 100 g de alimento (Parte comestible):

• Huevo entero: 12,4g proteína; 11,1g grasa; 1,5g carbohidratos; 55mg Ca; 200mg P; 2,8mg Fe

• Clara: 10,8g proteína; 0,2g grasa; 0,6g carbohidratos; 7mg Ca; 16mg P; 0,2mg Fe

• Yema:16,1g proteína; 31,6g grasa; 1,2g carbohidratos;145mg Ca; 550mg P; 6,8mg Fe

Proteinas en la clara de huevo:

• ovalbumina: ~54%, glicoproteina, estructura de la clara, ~45000Da, pI 4.7, albumina
• ovotransferrina: ~13%, glicoproteina, transporte de hierro y antimicrobiana, ~78000Da, albumina
• lysozima: ~3.5%, antimicrobiana, ~14600Da,pI 11.1, albumina
• ovomucina: ~1.5%, glicoproteína, estructura de la clara
  

Secuencia de amino ácidos de la lisosima de gallina

>gi45384212refNP_990612.1 lysozyme [Gallus gallus]

MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCVAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMSAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL

Pi= 9.4   pm 16240 Da

TAREA: DETERMINAR EL PUNTO ISOELECTRICO DE CADA PEPTIDO

1. MRSLLILVLCF
2. LPLAALGKVFG
3. RCELAAAMKRH
4. GLDNYRGYSLG
5. NWVCVAKFESN
6. FNTQATNRNTD
7. GSTDYGILQIN
8. SRWWCNDGRTP
9. GSRNLCNIPCSA
10. LLSSDITASVN
11. CAKKIVSDGNGM
12. SAWVAWRNRCKG
13. TDVQAWIRGCRL