corrección tarea cromatografía de intercambio iónico

Responda las primeras siete preguntas con base en la práctica de cromatografía de intercambio iónico realizada en el laboratorio.

1 Cuál es el fundamento de la reacción de ninhidrina? Escriba la reacción de la ninhidrina con el ácido glutámico e histidina y diga a qué se debe el color en la reacción? (indíquelo en la reacción)

2 Cómo se obtiene el amortiguador de fosfato 67mmol/l pH 6,8? Realice cálculos y ecuación

Respuesta:

Guiándose por lo expuesto en los materiales y métodos de la guía, lo primero es determinarla concentración en mmol/L de las sales de KH₂PO₄ y Na₂HPO₄-2H₂O, entonces:

(9,08g KH₂PO₄ / 1L) (1g-mol KH₂PO₄ / 136,1g KH₂PO₄)= 66,72mmol/L de KH₂PO₄

(11,88g Na₂HPO₄-2H₂O / 1L) ( 1g-mol Na₂HPO₄-2H₂O / 178g Na₂HPO₄-2H₂O) = 66,74mmol/L Na₂HPO₄-2H₂O

Ya que la concentración de las soluciones madre es igual a la deseada, es necesario saber las proporciones de las dos sales para tener un equilibrio a 67mmol/L pH 6,8

primero se escriben las ecuaciones:

H₃PO₄ pKa1 = 2,14; pKa2 = 6,86; pKa3 12,4

la disociación que se utilizara será la del segundo pKa (6,86)

H₃PO₄ ----------- > H₂PO₄^-1 ------- > HPO₄^-2

se busca que estén en equilibrio [ HPO₄^-2] / [ H₂PO₄^-1]

el equilibrio será dado por las sales [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄]

como las sales provienen de dos bases fuertes entonces se disociaran completamente generando los dos iones de interés, para saber las proporciones que se deben adicionar de cada sal se usa la ecuación de Henderson-Hasselbalch,

6,8 = 6,86 + log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄]

log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 6,8-6,86

log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = -0,06

[ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 10^-0,06 (antilogaritmo)

[ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 0,87

eso indica que por 1 parte de [ KH₂PO₄] hay 0,87 partes de [ Na₂HPO₄-2H₂O]

sumando las dos partes hay en total 1,87, ese total es el 100%, así podemos saber el porcentaje de cada sal. entonces, 53,47% de [ KH₂PO₄] y 46,52% de [ Na₂HPO₄-2H₂O], eso quiere decir que se toman 53,47ml de [ KH₂PO₄] y 46,52ml de [ Na₂HPO₄-2H₂O] para un volumen total de 100ml. Este resultado muestra una diferencia con la guía, es posible que la guía haya usado un valor de pKa diferente y de allí las diferencias, el pKa que usamos aquí es el reportado en la Bioquímica de Matthews (pag 46).

3 Cuál es la proporción de las cargas netas de cada amino ácido a pH 6,8?

Respuesta:

Para conocer las proporciones de las cargas se aplica de nuevo la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

Para la histidina:

pH = pKa + log [H₃N⁺---C---(R)---COO^-] / [H₃N⁺---C---(R⁺H)---COO^-], vamos a llamar “T” a toda la parte del logaritmo para no tener que escribir eso tan largo cada vez.

pH = pKa + logT

logT = pH - pKa

logT = 6,8 – 6

logT = 0,8

T = 10^0,8

T = 6,31

eso indica que por 1 parte de la histidina con el radical protonado (denominador) hay 6,31 partes de la histidina con el radical sin protonar. Sumando estas dos partes hay un total de 7,31 partes y eso es el 100%.

sacando los porcentajes tenemos que hay 86,32% de la histidina con el radical sin protonar, o sea 86,32% esta con carga neta de cero. y 13,68% de la histidina tiene el radical protonado, o sea 13,68% esta con carga neta de +1.

Para el acido glutámico:

se soluciona igual, entonces

pH = pKa + log [H₃N⁺---C---(R^-)---COO^-] / [H₃N⁺---C---(R)---COO^-],vamos a llamar la parte de logaritmo como “W”,

pH = pKa + logW

logW = pH – pKa

logW = 6,8 – 4,2

logW = 2,6

W = 10^2,6 (antilogaritmo)

W = 398,11

eso quiere decir que por cada parte de acido glutámico con el radical sin ionizar (denominador) hay 398,11 partes del acido glutámico con el radical ionizado. Sumando las partes tenemos un total de 399,11 partes y eso es el 100%, asi podemos saber el porcentaje de las dos formas. entonces, 99,75% del acido glutámico tiene el radical ionizado, es decir el 99,75% del acido tiene carga neta -1, mientras que el 0,25% es del acido glutámico con el radical sin ionizar, o sea el 0,25% del acido tiene una carga neta de cero.

4 Qué pH tiene la columna después de adicionar el hidróxido de sodio 0,1mol/l?

Respuesta:

Primero hay que determinar el pH de la solución de NaOH 0,1mol/l

0,1mol NaOH ------ > 0,1mol Na⁺ + 0,1mol OH^-

pOH = -log [OH^-]

pOH = -log 0,1

pOH = 1

pH = 14 – pOH

pH = 14 – 1

pH = 13

desde el momento de adicionar el NaOH 0,1 mol/l el pH empezara a aumentar de 6,8, al final de pasar 2 o mas volúmenes de NaOH 0,1 mol/l la columna tendrá un pH de 13 aproximadamente.

5 Por qué la histidina es retenida por la resina a pH 6,8?

Respuesta:

Porque parte de la histidina esta cargada positivamente e interactua con el intercambiador cationico de la columna.

Nota: el pI de la histidina es de 7,6, por debajo de su pI la carga neta será positiva y por arriba del pI las cargas netas son negativas. Entre mas alejado este el pH del pI mayor serán las cargas positivas o negativas. Para retener amino ácidos o proteínas es recomendable hacerlo una unidad por arriba o abajo del pI para que después sea fácil liberarlo de la resina. Como estamos usando una resina de intercambio cationico, o sea que las moléculas cargadas positivamente van a desplazar a los iones de sodio de la resina, la histidina cargada positivamente interactuara con la resina. Entonces la histidina a pH 6,8 esta casi una unidad por debajo de su pI, una parte esta cargada positivamente (~13,68%) y la otra parte tendrá cargada neta cero. la hisitidina al correr por la columna puede estar cambiando en un rango de carga positiva de 13,68% a mas, las cargas de las moléculas no son estáticas y pueden tener pequeños cambios al correr por la columna, y eso hace que al final casi toda la histidina interactúe con la resina de intercambio cationico.

6 Por qué el ácido glutámico no es retenido por la resina a pH 6,8?

El pI del ácido glutámico es de 3,2 a pH de 6,8 la mayoría del ácido se encuentra con carga neta negativa y no interactúa con la resina intercambiadora de cationes.

7 Por qué la histidina es liberada cuando aumenta el pH de la columna?

Porque al aumentar el pH, las cargas netas de la histidina cambiaran a cero y luego serán negativas, eso hará que no haya interacción con la resina de intercambio cationico y la histidina se libera.

8 Se desea conocer la cantidad de amino acidos presentes en la proteína R. La proteína R es: i)una globulina citoplasmática presente en las raíces de las plantas de cacao; ii) es glucosidasa, hidroliza glucosa de la pared celular; iii) su pm es 38.000Da; iv) su pI es 6,3.

Para purificar la enzima se realizó un cultivo de las células de las raíces de cacao, después de su crecimiento las células se recogieron por filtración, las células en el papel de filtro fueron maceradas en un amortiguador de fosfato pH 7 a 4^oC. El macerado fue centrifugado para remover los detritos, el sobrenadante fue llevado a un pH de 6,3 y saturado 50% con una solución saturada de sulfato de amonio, el precipitado fue disuelto en agua y dializado contra agua por dos días a 4^oC. El dializado fue adicionado a una columna cromatográfica de exclusión, la fracción con actividad de glucosidasa y peso correspondiente a 38.000Da fue hidrolizada en acido a 100^oC por 3 horas.

El producto de la hidrólisis acida fue adicionado a una columna con intercambiador catiónico (Dowex AG 50 W-X2, el intercambiador es el ácido sulfónico en forma de sal sódica SO3^-Na⁺). El amortiguador fosfato de sodio fue usado para eluir la columna. La elución empezó a un pH de 3 y el amortiguador fue cambiando cada 3 volúmenes a pH de 3,5 / 4 / 4,5 / 5 / 5,5 / 6 / 6,5 / 7

Dibuje el perfil de elusión de los amino ácidos, asuma que los 20 amino ácidos se encuentran libres en el producto de la hidrólisis ácida. Indique en el perfil el pH usado para la elución.

Nota: para hacer el ejercicio es necesario saber la carga neta de cada amino ácido a cada pH de elución.

Respuesta:

los amino ácidos serán eluidos en el siguiente orden:

1 ácido aspartico

2 ácido glutámico

3 asparagina

4 fenilalanina

5 glutamina

6 serina

7 metionina

8 triptofano

9 glicina

10 valina

11 leucina

12 alanina

13 isoleucina

14 prolina

15 treonina

16 histidina

17 lisina

18 cisteina

19 tirosina

20 arginina

Respuesta ejercicios amortiguadores

Primer ejercicio

La actividad enzimática máxima de la enzima T es a un pH de 8, qué amortiguador podría usar para esta reacción? Realice los cálculos para obtener 500ml del amortiguador seleccionado a una concentración de 150mmol/l.

Respuesta:

Ya que la actividad máxima de la enzima es a un pH de 8, podían utilizar cualquier sal cuyo acido o base conjugada tuviese un pKa cercano a 8, por ejemplo: el ácido pirofosfórico pKa4 = 8,22; el ácido fosfórico pKa2 = 7,21; ion amonio pKa = 9,25

El cálculo lo podían hacer con cualquiera de ellos, vamos a tomar el ácido pirofosfórico para el ejercicio.

El primer paso es establecer la sal, entonces tomaremos pirofosfato de sodio.

Segundo, escribir la ecuación:

H₄P₂O₇ < ------ > H₃P₂O₇^-1

H₃P₂O₇^-1 < ------ > H₂P₂O₇^-2

H₂P₂O₇^-2 < ------- > HP₂O₇^-3

HP₂O₇^-3 < ----- > P₂O₇^-4 pKa 8,22

Entonces,

150mmol H₄P₂O₇ + 600mmol NaOH ------ > 150mmol Na₄P₂O₇ + 600mmol H₂O

150mmol Na₄P₂O₇ < ----- > 150mmol P₂O₇^-4 + 600mmol Na⁺

Tercero, escribir la ecuación de Henderson-Hasselbalch

pH = pKa + (log[P₂O₇^-4] – log [H₄P₂O₇])

entonces,

8 = 8,22 + log 150mmol/L – log [H₄P₂O₇]

log [H₄P₂O₇] = 8,22 + 2,18 -8

log [H₄P₂O₇] = 2,40

[H₄P₂O₇] = 10^2,40 (antilogaritmo)

[H₄P₂O₇] = 251,2 mmol/L

Cuarto, determinar cuánto tomar de las soluciones madre de H₄P₂O₇ y NaOH

V1 = (V2 * C2 ) / C1

V1 H₄P₂O₇ = (500ml * 251,2mmol/L) / 1500mmol/L

V1 H₄P₂O₇ = 83,73ml

V1 H₄P₂O₇ = (500ml * 150mmol/L) / 1500mmol/L

V1 H₄P₂O₇ = 50ml

Total H₄P₂O₇ = 133,73ml

V1 NaOH = (500ml * 600mmol/L ) / 1500mmol/L

V1 NaOH = 200ml

Finalmente, se plantea cómo se haría el amortiguador:

Se mezclan 200ml de NaOH, 133,73ml de H₄P₂O₇ y se lleva hasta 500ml con agua destilada, confirmar el pH con potenciómetro.

Segundo ejercicio

La actividad enzimática máxima de la enzima R es a un pH de 5, realice una solución amortiguadora de propionato de sodio 200mmol/l pH5 para la reacción enzimática.

Respuesta:

Este ejercicio se resuelve igual al anterior. pKa del ácido propiónico 4,87 (CH₃CH₂COOH).
podían tomar cualquier volumen final, para un litro la cantidad de ácido adicionado es 232ml y de base 133,33ml

Tercer ejercicio

La enzima M fue aislada de hígado de ratón, la actividad máxima de la enzima es a pH 3,5. Realice los cálculos para obtener un amortiguador a ese pH usando ácido láctico. La concentración de la sal debe ser de 50mmol/l en 150ml de solución amortiguadora.

Respuesta:

Este ejercicio se resuelve igual al anterior. pKa del ácido láctico 3,86 (CH₃CHOHCOOH).

Para formar la sal podían usar KOH o NaOH. Cantidad de ácido adicionado 16,48ml, cantidad de base 5ml.

Cuarto Ejercicio

La actividad máxima de la enzima Q es a un pH de 12, realice un amortiguador de fosfato 250mmol/l en 300ml a ese pH.

Respuesta:

Este ejercicio se puede resolver igual al anterior. pKa3 del acido fosfórico 12,3 (H₃PO₄)

H₃PO₄ + KOH -------- > KH₂PO₄

KH₂PO₄ ------ > K₂HPO₄

K₂HPO₄ ----- > K₃PO₄

Entonces globalizando la ecuación:

H₃PO₄ + 3 KOH -------- > K₃PO₄ + 3H₂O

250mmol H₃PO₄ + 750mmol KOH -------- > 250mmol K₃PO₄ + 750 H₂O

250mmol K₃PO₄ ------ > 250mmol PO₄^-3 + 750mmol K⁺

Escribiendo la ecuación de Henderson-Hasselbalch:

12 = 12,3 + log 250 – log [H₃PO₄]

log [H₃PO₄] = 2,7

[H₃PO₄] = 10^2,7

[H₃PO₄] = 501,2 mmol/L

Determinar los volúmenes a tomar de las soluciones madre a 1500mmol,

V1 [H₃PO₄] = (300ml * 501,2 mmol/L) / 1500mmol/L

V1 [H₃PO₄] = 100,24ml

V1 [H₃PO₄] = (300ml * 250 mmol/L) / 1500mmol/L

V1 [H₃PO₄] = 50ml

Volumen total de ácido 150,24ml

V1 KOH = (300ml * 750 mmol/L) / 1500 mmol/L

V1 KOH = 150ml

El amortiguador se hara mezclando 150ml de KOH y 150,24ml de H₃PO₄ para un volumen final de 300,24ml

Nota: La sal K₃PO₄ se forma con 150ml de KOH y 50ml de H₃PO₄ el amortiguador a pH 12 se dará con los 100,24ml de más de ácido.

Quinto ejercicio

Realice los cálculos para obtener un amortiguador de carbonato para la enzima Y cuya máxima actividad enzimática es a un pH de 9,5. Realice 400ml de amortiguador a una concentración de 70mmol/l.

Respuesta:

pKa2 del ácido carbónico 10,25 (H₂CO₃). Cantidad de ácido adicionado 122,41ml. Cantidad de base adicionada 37,33ml.

NOTA GENERAL

Recuerden que los amortiguadores también se pueden hacer con una sal que ya viene comercial y la adición de su correspondiente ácido o base débil. En estos ejercicios, todos fueron resueltos con la adición de un ácido débil y una base fuerte por separado para formar la sal en la solución, y con un exceso de ácido para lograr el amortiguador.

Tarea cromatografía de intercambio iónico

Responda las primeras siete preguntas con base en la práctica de cromatografía de intercambio iónico realizada en el laboratorio.

1) Cuál es el fundamento de la reacción de ninhidrina? Escriba la reacción de la ninhidrina con el ácido glutámico e histidina y diga a qué se debe el color en la reacción? (indíquelo en la reacción)

2) Cómo se obtiene el amortiguador de fosfato 67mmol/l pH 6,8? Realice cálculos y ecuación

3) Cuál es la proporción de las cargas netas de cada amino ácido a pH 6,8?

4) Qué pH tiene la columna después de adicionar el hidróxido de sodio 0,1mol/l?

5) Por qué el ácido glutámico no es retenido por la resina a pH 6,8?

6) Por qué la histidina es retenida por la resina a pH 6,8?

7) Por qué la histidina es liberada cuando aumenta el pH de la columna?

8) Se desea conocer la cantidad de amino ácidos presentes en la proteína R. La proteína R es: i)una globulina citoplasmática presente en las raíces de las plantas de cacao; ii) es glucosidasa, hidroliza glucosa de la pared celular; iii) su pm es 38.000Da; iv) su pI es 6,3.

Para purificar la enzima se realizó un cultivo de las células de las raíces de cacao, después de su crecimiento las células se recogieron por filtración, las células en el papel de filtro fueron maceradas en un amortiguador de fosfato pH 7 a 4^oC. El macerado fue centrifugado para remover los detritos, el sobrenadante fue llevado a un pH de 6,3 y saturado 50% con una solución saturada de sulfato de amonio, el precipitado fue disuelto en agua y dializado contra agua por dos días a 4^oC. El dializado fue adicionado a una columna cromatográfica de exclusión, la fracción con actividad de glucosidasa y peso correspondiente a 38.000Da fue hidrolizada en acido a 100^oC por 3 horas.

El producto de la hidrólisis acida fue adicionado a una columna con intercambiador catiónico (Dowex AG 50 W-X2, el intercambiador es el ácido sulfónico en forma de sal sódica SO3^-Na⁺). El amortiguador fosfato de sodio fue usado para eluir la columna. La elución empezó a un pH de 3 y el amortiguador fue cambiando cada 3 volúmenes a pH de 3,5 / 4 / 4,5 / 5 / 5,5 / 6 / 6,5 / 7

Dibuje el perfil de elusión de los amino ácidos, asuma que los 20 amino ácidos se encuentran libres en el producto de la hidrólisis ácida. Indique en el perfil el pH usado para la elución.

Nota: para hacer el ejercicio es necesario saber la carga neta de cada amino ácido a cada pH de elución.

figuras cromatografía de exclusión molecular

CROMATOGRAFíA DE EXCLUSIóN MOLECULAR

BIBLIOGRAFIA

Amersham Bioscience. 2002. Gel filtration, principles and methods, Handbook. Edition 18-102218. hacer click aquí para acceder a éste documento

Ejercicios soluciones amortiguadoras

Para los siguientes problemas parta de soluciones madres de 1,5mol/l. Los pKa de los ácidos los encuentran en la bioquímica de Lehninger y en la Bioquímica de Mathew.

1) La actividad enzimática máxima de la enzima T es a un pH de 8, qué amortiguador podría usar para esta reacción? Realice los cálculos para obtener 500ml del amortiguador seleccionado a una concentración de 150mmol/l.

2) La actividad enzimática máxima de la enzima R es a un pH de 5, realice una solución amortiguadora de propionato de sodio 200mmol/l pH5 para la reacción enzimática.

3) La enzima M fue aislada de hígado de ratón, la actividad máxima de la enzima es a pH 3,5. Realice los cálculos para obtener un amortiguador a ese pH usando ácido láctico. La concentración de la sal debe ser de 50mmol/l en 150ml de solución amortiguadora.

4) La actividad máxima de la enzima Q es a un pH de 12, realice un amortiguador de fosfato 250mmol/l en 300ml a ese pH.

5) Realice los cálculos para obtener un amortiguador de carbonato para la enzima Y cuya máxima actividad enzimática es a un pH de 9,5. Realice 400ml de amortiguador a una concentración de 70mmol/l.

Soluciones amortiguadoras

Para preparar una solución amortiguadora se tiene en cuenta el pH al que se necesita. En el caso de las enzimas, el amortiguador se usa al pH de la máxima actividad enzimática. Para garantizar que el pH se mantenga y que pequeños cambios en la concentración de H⁺ o OH^- (liberados en las reacciones químicas o enzimáticas) no afecten el pH, se usan amortiguadores con un pKa cercano al pH de la máxima actividad de la enzima. Además del pKa es necesario tener en cuenta que el amortiguador no sea toxico en la reacción, que sea estable y que se disuelva en agua fácilmente.

Para preparar un amortiguador siempre se necesita la sustancia amortiguadora en forma de sal y su respectivo ácido o base débil (conjugada); o dos sales que al disociarse generen el sistema amortiguador.

Hay varias formas para preparar una solución amortiguadora:

1 Se pesan las dos sales por separado y se disuelven en agua

2 Se pesan la base y ácido por separado para formar la sal se disuelve en agua y luego se adiciona un ácido o una base fuerte.

Ejemplo de los dos métodos para preparar soluciones amortiguadoras,

1 Problema; preparar 1L de 0,5mol/l amortiguador fosfato pH7,5

a) Determinar el componente principal del sistema amortiguador, esto no es problema con un acido monoproteico (ácido acético CH3COOH), sin embargo con los sistemas diproticos (H2PO4-) o poliproticos (H3PO4) el somponente cambia dependiendo del ph deseado.

En éste caso el sistema será H2PO4^-/HPO4^-2 porque su pKa es de 7,21. El sistema H3PO4/H2PO4- tiene un pKa de 2,12 y el sistema HPO4^-2/PO4^-3 tiene un pKa de 12,3; estos valores son muy altos o muy bajos para el amortiguador que deseamos preparar (pH 7,5) y ninguno de los dos será un buen amortiguador a pH 7,5.

b) después de definir los componentes se escribe la ecuación de equilibrio y se identifica el par de ácido o base conjugado:

H2PO4^- <-------> HPO4^-2 + H⁺ pKa 7,21

c) se calcula la proporción deseada de ácido y base a partir de la ecuación de Henderson-Hasselbalch

pH = pKa + log [HPO4^-2] – log [H2PO4^-]

log [H2PO4^-] - log [HPO4^-2] = 7,21 – 7,5

-1 (log [H2PO4^-] - log [HPO4^-2]) = -1 ( 7,21 – 7,5)

log [HPO4^-2] - log [H2PO4^-] = 7,5-7,21

log [HPO4^-2] - log [H2PO4^-] = 0,29

[HPO4^-2] / [H2PO4^-] = 10^0,29 (antilogaritmo)

[HPO4^-2] / [H2PO4^-] = 1,95

Esto significa 1,95 partes de [HPO4^-2] por 1 parte de [H2PO4^-], osea un total de una parte de 2,95. Con este total (2,95) se puede calcular el porcentaje de cada compuesto:

% HPO4^-2 = (1,95 / 2,95) x 100 = 66.2%

%H2PO4^- = (1 / 2,95) x 100 = 33,8%

d) Calcular cuánto se pesa de cada uno en forma de sal para obtener las soluciones de K2HPO4 y de KH2PO4. Estas sales en solución se ionizan completamente y darán los dos componentes del amortiguador.

Necesitamos el 66,2% de 1 mol de K2HPO4 y 33,8% de 1 mol de %KH2PO4 para 1 L, entonces:

(66,2% x 1 mol) / 100% = 0,662 mol de K2HPO4 y (33,8% x 1 mol ) / 100% = 0,338 mol de KH2PO4. Como las soluciones deben tener 0,5 mol/L (mirar enunciado), entonces:

(0,662 mol x 0,5 L) / 1L = 0,331 mol de K2HPO4 en 0,5L de agua y,

(0,338 mol x 0,5 L ) / 1L = 0,169 mol de KH2PO4 en 0,5L de agua

Para saber cuánto en gramos es:

(0,331 mol x 174,2g/mol) / 1 mol = 57,7g de K2HPO4

(0,169 mol x 136,1 g/mol) 1mol = 23g de KH2PO4

e) Para preparar el amortiguador, pesar 23 g de KH2PO4 y 57,7g de K2HPO4 y disolver hasta mas o menos 750ml de agua destilada. Comprobar el pH con un potenciómetro y ajustar con ácido o base si es necesario, finalmente completar hasta 1L con agua destilada.

2) Segunda forma de preparar el amortiguador:

Esta es la forma del enunciado del parcial.

Tenga en cuenta que en el enunciado anterior se dice 0,5 mol/l del amortiguador fosfato, no 0,5 mol/l de la sal fosfato de potasio, la concentración se refiere al sistema fosfato. Si el enunciado dice preparar un amortiguador 0,1mol/l de acetato de potasio, esta concentración se está refiriendo a la concentración de la sal y necesita determinar los componentes de la sal, en este caso es el ácido acético y el hidróxido de potasio.

Realice los cálculos para obtener 200ml de acetato de potasio 100 mmol/l pH5 a partir de soluciones madre 1mol/l de ácido acético y 1mol/l de hidróxido de potasio. Pka del ácido acético 4,76

a) Escribir la ecuación de la mezcla de las dos soluciones para obtener la sal, se necesita una sal de 0,1mol:

0,1mol CH3COOH + 0.1mol KOH <--------> 0,1mol CH3COOK + H2O

0,1mol CH3COOK <------> 0,1mol CH3COO^- + 0.1mol K⁺

b) Ya sabe la concentración del ion acetate, ahora necesita la concentración del ácido acético, para hallarla utiliza la ecuacion de Henderson-Hasselbalch:

pH = pKa + log [CH3COO^-] - log [CH3COOH]

log [CH3COOH] = pKa – pH + log [CH3COO^-]

log [CH3COOH] = 4,76 – 5 + log 0,1

log [CH3COOH] = -1,24

[CH3COOH] = 10^-124 (antilogaritmo)

[CH3COOH] = 0,057 mol/l

c) Ya sabe la concentración de los componentes que forman la sal y la cantidad de ácido acético de más para obtener el amortiguador acetato de potasio 0,1mol/l pH 5. Necesita hacer los cálculos para saber cuánto tomar de las soluciones madres:

V1 = (200ml x 01,mol/l ) / 1mol/l KOH = 20ml de de 1mol/l KOH

V1= (200ml x 01,mol/l ) / 1mol/l CH3COOH = 20ml de de 1mol/l CH3COOH

V1 = (200ml x 0,057 mol/l) 1mol/l CH3COOH = 11,4ml de 1mol/l CH3COOH

Entonces;

Mezclar 20 ml de 1mol/l KOH con 31,4ml de CH3COOH llevar hasta 180ml con agua destilada, verificar el pH (si es necesario cuadrar con KOH o CH3COO), posteriormente llevar hasta 200ml con agua destilada .

La sal se formara a partes iguales del ácido y la base y el ácido restante hará parte de la amortiguación a pH 5.

Bibliografía:

Bohinski Robert. 1987. Modern Concepts in Biochemistry. Chapter 2: Noncovalent bonding and pH buffering. Fifth Edition. Woodstock Publishers' Services. USA.

Corrección del 3er quiz 6 de noviembre

lo que esta en paréntesis no tenían que escribirlo, es explicación

1) En cada paso se debe cuantificar las proteínas por prueba de Biuret o xantoproteica o Lowry o Bradford. Hacer seguimiento de la purificación por electroforesis, determinar actividad enzimático
a) Tomar hojas jóvenes
b) romper células
c) separar detritos de citoplasma
d) tomar el citoplasma
e) hacer salting out a 50%, las globulinas precipitan mas o menos a esa saturación de sal
f) separar el precipitado
g) resuspender el precipitado en agua y limpiar por diálisis
h) realizar cromatografía del dializado (para purificar la proteína T ya que en el citoplasma pueden haber numerosas globulinas)
1. cromatografía de exclusión molecular (que separe ejemplo de 5000 a 20000Da)
2. cromatografía de intercambio iónico (pI 8)
3. cromatografía de afinidad (glucosidasa)
i) verificar pureza con electroforesis, determinar % de rendimiento y actividad de la enzima

2)
En la prueba de Bradford la cargas positivas de las proteínas se unen a las cargas negativas del colorante azul brillante de Coomassie. El colorante en solución es de color rojo y al unirse con las cargas positivas de las proteínas cambia a color azul.

3)
la prueba de Biuret determina enlaces peptídico por reacción en medio alcalino de iones de cobre con los nitrógenos de los enlaces peptídico. La prueba de Lowry es una modificación de la prueba de Biuret, en la que el producto de la prueba de Biuret (proteína-cobre) reduce el reactivo de folin, esto aumenta 100 veces la sensibilidad.

4)
a)
-una parte es reflejada
-otra parte es absorbida por las moléculas de la sustancia
-otra parte es transmitida a través de la solución

b) las moléculas en una solución de color violeta adsorben en la longitud de onda del color opuesto al violeta. El color opuesto del violeta es el naranja que tiene una longitud de onda de aproximadamente 600 a 650nm, en este rango se puede determinar la concentración de las moléculas en la solución violeta.

5)
Solución madre al 30% de albúmina bovina. curva de calibración con concentraciones (ejemplo) 2,3,5,7,10mg/l

a) convertir la concentración de 30% a mg/l
1000ml -100%
X 30%
X= (30% x 1000ml) / 100%
X = 300ml=300g en 1L = 300000mg/l

b) diluciones en serie
1ml de solución madre + 9ml de agua = dilución 1/10 concertación del tubo 30000mg/l
1ml de 1/10 + 9ml de agua = dilución 1/100 concentración del tubo 3000mg/l
1ml de 1/100 + 9ml de agua = dilución 1/1000 concentración del tubo 300mg/l
1ml de 1/1000 + 9ml de agua = dilución 1/10000 concertación del tubo 30mg/l

c) a partir del ultimo tubo se pueden hacer las patrones de la curva de calibración

V1 = (1ml x 10mg/l) / 30mg/l = 0.333ml + 0.667ml de agua

V1 = (1ml x 7mg/l) / 30mg/l = 0.233ml +0.767ml de agua

V1 = (1ml x 5mg/l) /30mg/l = 0.166ml +0.834ml de agua

V1 = (1ml x 3mg/l) / 30mg/l = 0.1ml +0.9ml de agua

V1 = (1ml x 2mg/l) /30mg/l = 0.066ml +0.934ml de agua