Tarea cromatografía de intercambio iónico

Responda las primeras siete preguntas con base en la práctica de cromatografía de intercambio iónico realizada en el laboratorio.

1) Cuál es el fundamento de la reacción de ninhidrina? Escriba la reacción de la ninhidrina con el ácido glutámico e histidina y diga a qué se debe el color en la reacción? (indíquelo en la reacción)

2) Cómo se obtiene el amortiguador de fosfato 67mmol/l pH 6,8? Realice cálculos y ecuación

3) Cuál es la proporción de las cargas netas de cada amino ácido a pH 6,8?

4) Qué pH tiene la columna después de adicionar el hidróxido de sodio 0,1mol/l?

5) Por qué el ácido glutámico no es retenido por la resina a pH 6,8?

6) Por qué la histidina es retenida por la resina a pH 6,8?

7) Por qué la histidina es liberada cuando aumenta el pH de la columna?

8) Se desea conocer la cantidad de amino ácidos presentes en la proteína R. La proteína R es: i)una globulina citoplasmática presente en las raíces de las plantas de cacao; ii) es glucosidasa, hidroliza glucosa de la pared celular; iii) su pm es 38.000Da; iv) su pI es 6,3.

Para purificar la enzima se realizó un cultivo de las células de las raíces de cacao, después de su crecimiento las células se recogieron por filtración, las células en el papel de filtro fueron maceradas en un amortiguador de fosfato pH 7 a 4^oC. El macerado fue centrifugado para remover los detritos, el sobrenadante fue llevado a un pH de 6,3 y saturado 50% con una solución saturada de sulfato de amonio, el precipitado fue disuelto en agua y dializado contra agua por dos días a 4^oC. El dializado fue adicionado a una columna cromatográfica de exclusión, la fracción con actividad de glucosidasa y peso correspondiente a 38.000Da fue hidrolizada en acido a 100^oC por 3 horas.

El producto de la hidrólisis acida fue adicionado a una columna con intercambiador catiónico (Dowex AG 50 W-X2, el intercambiador es el ácido sulfónico en forma de sal sódica SO3^-Na⁺). El amortiguador fosfato de sodio fue usado para eluir la columna. La elución empezó a un pH de 3 y el amortiguador fue cambiando cada 3 volúmenes a pH de 3,5 / 4 / 4,5 / 5 / 5,5 / 6 / 6,5 / 7

Dibuje el perfil de elusión de los amino ácidos, asuma que los 20 amino ácidos se encuentran libres en el producto de la hidrólisis ácida. Indique en el perfil el pH usado para la elución.

Nota: para hacer el ejercicio es necesario saber la carga neta de cada amino ácido a cada pH de elución.