corrección tarea cromatografía de intercambio iónico

Responda las primeras siete preguntas con base en la práctica de cromatografía de intercambio iónico realizada en el laboratorio.

1 Cuál es el fundamento de la reacción de ninhidrina? Escriba la reacción de la ninhidrina con el ácido glutámico e histidina y diga a qué se debe el color en la reacción? (indíquelo en la reacción)

2 Cómo se obtiene el amortiguador de fosfato 67mmol/l pH 6,8? Realice cálculos y ecuación

Respuesta:

Guiándose por lo expuesto en los materiales y métodos de la guía, lo primero es determinarla concentración en mmol/L de las sales de KH₂PO₄ y Na₂HPO₄-2H₂O, entonces:

(9,08g KH₂PO₄ / 1L) (1g-mol KH₂PO₄ / 136,1g KH₂PO₄)= 66,72mmol/L de KH₂PO₄

(11,88g Na₂HPO₄-2H₂O / 1L) ( 1g-mol Na₂HPO₄-2H₂O / 178g Na₂HPO₄-2H₂O) = 66,74mmol/L Na₂HPO₄-2H₂O

Ya que la concentración de las soluciones madre es igual a la deseada, es necesario saber las proporciones de las dos sales para tener un equilibrio a 67mmol/L pH 6,8

primero se escriben las ecuaciones:

H₃PO₄ pKa1 = 2,14; pKa2 = 6,86; pKa3 12,4

la disociación que se utilizara será la del segundo pKa (6,86)

H₃PO₄ ----------- > H₂PO₄^-1 ------- > HPO₄^-2

se busca que estén en equilibrio [ HPO₄^-2] / [ H₂PO₄^-1]

el equilibrio será dado por las sales [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄]

como las sales provienen de dos bases fuertes entonces se disociaran completamente generando los dos iones de interés, para saber las proporciones que se deben adicionar de cada sal se usa la ecuación de Henderson-Hasselbalch,

6,8 = 6,86 + log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄]

log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 6,8-6,86

log [ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = -0,06

[ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 10^-0,06 (antilogaritmo)

[ Na₂HPO₄-2H₂O] / [ KH₂PO₄] = 0,87

eso indica que por 1 parte de [ KH₂PO₄] hay 0,87 partes de [ Na₂HPO₄-2H₂O]

sumando las dos partes hay en total 1,87, ese total es el 100%, así podemos saber el porcentaje de cada sal. entonces, 53,47% de [ KH₂PO₄] y 46,52% de [ Na₂HPO₄-2H₂O], eso quiere decir que se toman 53,47ml de [ KH₂PO₄] y 46,52ml de [ Na₂HPO₄-2H₂O] para un volumen total de 100ml. Este resultado muestra una diferencia con la guía, es posible que la guía haya usado un valor de pKa diferente y de allí las diferencias, el pKa que usamos aquí es el reportado en la Bioquímica de Matthews (pag 46).

3 Cuál es la proporción de las cargas netas de cada amino ácido a pH 6,8?

Respuesta:

Para conocer las proporciones de las cargas se aplica de nuevo la ecuación de Henderson-Hasselbalch.

Para la histidina:

pH = pKa + log [H₃N⁺---C---(R)---COO^-] / [H₃N⁺---C---(R⁺H)---COO^-], vamos a llamar “T” a toda la parte del logaritmo para no tener que escribir eso tan largo cada vez.

pH = pKa + logT

logT = pH - pKa

logT = 6,8 – 6

logT = 0,8

T = 10^0,8

T = 6,31

eso indica que por 1 parte de la histidina con el radical protonado (denominador) hay 6,31 partes de la histidina con el radical sin protonar. Sumando estas dos partes hay un total de 7,31 partes y eso es el 100%.

sacando los porcentajes tenemos que hay 86,32% de la histidina con el radical sin protonar, o sea 86,32% esta con carga neta de cero. y 13,68% de la histidina tiene el radical protonado, o sea 13,68% esta con carga neta de +1.

Para el acido glutámico:

se soluciona igual, entonces

pH = pKa + log [H₃N⁺---C---(R^-)---COO^-] / [H₃N⁺---C---(R)---COO^-],vamos a llamar la parte de logaritmo como “W”,

pH = pKa + logW

logW = pH – pKa

logW = 6,8 – 4,2

logW = 2,6

W = 10^2,6 (antilogaritmo)

W = 398,11

eso quiere decir que por cada parte de acido glutámico con el radical sin ionizar (denominador) hay 398,11 partes del acido glutámico con el radical ionizado. Sumando las partes tenemos un total de 399,11 partes y eso es el 100%, asi podemos saber el porcentaje de las dos formas. entonces, 99,75% del acido glutámico tiene el radical ionizado, es decir el 99,75% del acido tiene carga neta -1, mientras que el 0,25% es del acido glutámico con el radical sin ionizar, o sea el 0,25% del acido tiene una carga neta de cero.

4 Qué pH tiene la columna después de adicionar el hidróxido de sodio 0,1mol/l?

Respuesta:

Primero hay que determinar el pH de la solución de NaOH 0,1mol/l

0,1mol NaOH ------ > 0,1mol Na⁺ + 0,1mol OH^-

pOH = -log [OH^-]

pOH = -log 0,1

pOH = 1

pH = 14 – pOH

pH = 14 – 1

pH = 13

desde el momento de adicionar el NaOH 0,1 mol/l el pH empezara a aumentar de 6,8, al final de pasar 2 o mas volúmenes de NaOH 0,1 mol/l la columna tendrá un pH de 13 aproximadamente.

5 Por qué la histidina es retenida por la resina a pH 6,8?

Respuesta:

Porque parte de la histidina esta cargada positivamente e interactua con el intercambiador cationico de la columna.

Nota: el pI de la histidina es de 7,6, por debajo de su pI la carga neta será positiva y por arriba del pI las cargas netas son negativas. Entre mas alejado este el pH del pI mayor serán las cargas positivas o negativas. Para retener amino ácidos o proteínas es recomendable hacerlo una unidad por arriba o abajo del pI para que después sea fácil liberarlo de la resina. Como estamos usando una resina de intercambio cationico, o sea que las moléculas cargadas positivamente van a desplazar a los iones de sodio de la resina, la histidina cargada positivamente interactuara con la resina. Entonces la histidina a pH 6,8 esta casi una unidad por debajo de su pI, una parte esta cargada positivamente (~13,68%) y la otra parte tendrá cargada neta cero. la hisitidina al correr por la columna puede estar cambiando en un rango de carga positiva de 13,68% a mas, las cargas de las moléculas no son estáticas y pueden tener pequeños cambios al correr por la columna, y eso hace que al final casi toda la histidina interactúe con la resina de intercambio cationico.

6 Por qué el ácido glutámico no es retenido por la resina a pH 6,8?

El pI del ácido glutámico es de 3,2 a pH de 6,8 la mayoría del ácido se encuentra con carga neta negativa y no interactúa con la resina intercambiadora de cationes.

7 Por qué la histidina es liberada cuando aumenta el pH de la columna?

Porque al aumentar el pH, las cargas netas de la histidina cambiaran a cero y luego serán negativas, eso hará que no haya interacción con la resina de intercambio cationico y la histidina se libera.

8 Se desea conocer la cantidad de amino acidos presentes en la proteína R. La proteína R es: i)una globulina citoplasmática presente en las raíces de las plantas de cacao; ii) es glucosidasa, hidroliza glucosa de la pared celular; iii) su pm es 38.000Da; iv) su pI es 6,3.

Para purificar la enzima se realizó un cultivo de las células de las raíces de cacao, después de su crecimiento las células se recogieron por filtración, las células en el papel de filtro fueron maceradas en un amortiguador de fosfato pH 7 a 4^oC. El macerado fue centrifugado para remover los detritos, el sobrenadante fue llevado a un pH de 6,3 y saturado 50% con una solución saturada de sulfato de amonio, el precipitado fue disuelto en agua y dializado contra agua por dos días a 4^oC. El dializado fue adicionado a una columna cromatográfica de exclusión, la fracción con actividad de glucosidasa y peso correspondiente a 38.000Da fue hidrolizada en acido a 100^oC por 3 horas.

El producto de la hidrólisis acida fue adicionado a una columna con intercambiador catiónico (Dowex AG 50 W-X2, el intercambiador es el ácido sulfónico en forma de sal sódica SO3^-Na⁺). El amortiguador fosfato de sodio fue usado para eluir la columna. La elución empezó a un pH de 3 y el amortiguador fue cambiando cada 3 volúmenes a pH de 3,5 / 4 / 4,5 / 5 / 5,5 / 6 / 6,5 / 7

Dibuje el perfil de elusión de los amino ácidos, asuma que los 20 amino ácidos se encuentran libres en el producto de la hidrólisis ácida. Indique en el perfil el pH usado para la elución.

Nota: para hacer el ejercicio es necesario saber la carga neta de cada amino ácido a cada pH de elución.

Respuesta:

los amino ácidos serán eluidos en el siguiente orden:

1 ácido aspartico

2 ácido glutámico

3 asparagina

4 fenilalanina

5 glutamina

6 serina

7 metionina

8 triptofano

9 glicina

10 valina

11 leucina

12 alanina

13 isoleucina

14 prolina

15 treonina

16 histidina

17 lisina

18 cisteina

19 tirosina

20 arginina